В МОИП состоялась лекция
Андрея Диева на тему
«Принципы микроклонального размножения. Адаптация меристемных растений.»
А. Диев поделился своими практическими наработками по адаптации и доращиванию меристемных растений, которые он на протяжении уже нескольких лет приобретает в Компании «Микроклон» (во всё возрастающих объёмах).
Микроклональное размножение растений делится на два этапа – непосредственно размножение растений in vitro (проводится в лаборатории) и последующая адаптация меристемных растений.
Первый этап представляет из себя, образно говоря, «микрочеренкование» (массовое размножение при помощи «микрочеренков»). У растения срезают тонкий (0,8 мм) слой с верхушки почки, который содержит клетки верхушечной меристемы. Этот материал помещают на стерильную питательную среду на основе агара (среда в обязательном порядке содержит сахара, питательные элементы, а также в среды на разных этапах микроразмножения могут добавлять фитогормоны). Растительные клетки активно делятся, на питательной среде начинает формироваться маленькое растение – и через некоторое время у него снова срезают верхушечную меристему и переносят на новую питательную среду. Такие пересевы («пассажи») производят несколько раз, в результате растительные клетки адаптируют к развитию на искусственных питательных средах. Затем микрорастение проверяют на заражённость вирусами (меристемное растение должно быть от них свободно). Пробы отдают на анализ в молекулярно-биологическую лабораторию, тест на один вирус стоит порядка 500-700 рублей, набор проверяемых вирусов различен для разных культур. Так, малину проверяют на 5 вирусов. После этого приступают к массовому размножению «чистого» микрорастения. В питательную среду добавляют фитогормон, стимулирующий образование побегов, с которых срезают «микрочеренки» и помещают их на агар (все операции проводят в стерильных условиях, используя ламинарные шкафы). Технология массовая – за одну рабочую смену оператор делает до 800 микрочеренков. Далее – изменяют состав питательной среды, и меристемные растения начинают образовывать корни. Растения какое-то время подращивают (они находятся в герметичных баночках, на стеллажах с круглосуточным освещением). На этой стадии меристемные растения можно поместить на хранение в холодильник на несколько месяцев. Для некоторых культур это даже является положительным моментом – например, для микроклональной сирени, которая после этого лучше развивается и идёт в рост.
Для дальнейшего выращивания меристемных растений необходима
процедура адаптации, во время которой должны произойти фундаментальные физиологические перестройки. Меристемные растения надо «приучить» к «растительному» образу жизни и перестроить весь их обмен веществ. Размноженные микроклонально растения привыкли не фотосинтезировать, а получать углеводы из питательной среды (фотосинтез не возможен при всём желании, т.к. меристемные растения находятся в замкнутом объёме без доступа строительного сырья – углекислого газа из окружающей среды). Корни у меристемных растений толстые, похожие на спички, и не имеют всасывающих волосков. Ввиду 100%-ной влажности среды, на листьях полностью открыты устьица, а листовые пластинки не имеют воскового слоя.
Несмотря на всю фундаментальность поставленных задач, инструментально это достигается очень просто – растения помещают в условия со стабильной температурой, достаточным освещением (для фотосинтеза) и постепенно уменьшают влажность среды. Для начала полученные меристемные растения пересаживают (из «Микроклона» они поступают в герметичных пластиковых коробочках по 20 шт. растений размером несколько сантиметров, находящихся на питательном агарозном геле). Растения берут пинцетом и осторожно и тщательно отмывают корни водой комнатной температуры от агара. Это необходимо, т.к. иначе агар будет служить замечательной питательной средой для патогенных микроорганизмов. Высадку проводят в кассеты, в торфяные таблетки диаметром 33 мм или кокосовые диаметром 30 мм. Кассеты ставят на стеллаж с освещением, стеллаж накрывают полиэтиленовой плёнкой (100% влажность). Потом плёнку начинают чуть приоткрывать на некоторое время, затем всё больше и больше, и наконец снимают совсем. Процесс адаптации занимает максимум 4 недели, в среднем 2-3. Полив под корень не применяют. Под кассеты подкладывают капиллярный мат (самодельный: сложенный втрое нетканый материал, накрытый сверху мешком из-под сахара), который увлажняют не чаще одного раза в сутки – влага из него через дырочки в кассете поступает к растениям. Также периодически опрыскивают растения, в том числе с растворами удобрений в качестве подкормки. Подкормки комплексными удобрениями по листьям можно начинать с 4 дня адаптации, концентрацию берут поменьше, но обрабатывают почаще. При дальнейшем доращивании растений развитие корневой системы достигается перевалкой, проводимой несколько раз во всё большие по объёму горшки.
В сотрудничестве с «Микроклоном» А. Диев массово размножает довольно много декоративных культур, из плодово-ягодных – землянику, малину, ежевику, виноград, один сорт крыжовника, приступили к вопросу микроклонального размножения 2 сортов яблони, есть планы по абрикосу. По личным наблюдениям, увеличения урожайности у микроклонально размноженных ягодных культур не наблюдается (т.е. она не превышает максимальную для сорта). Однако есть очень много других плюсов. Меристемное растение как бы «обнуляет счётчик» - оно является ювенильным (по всем морфологическим признакам). Но в то же время оно ведёт себя как взрослое – поэтому наблюдается лучшее развитие таких растений, с очень большой скоростью. Так, ремонтантные сорта малины, поставленные на адаптацию в январе – в сентябре уже с плодами. У ежевики за аналогичные сроки плеть вырастает до 1,2 м. Растения получаются изначально абсолютно здоровыми, поэтому лучше противостоят патогенам и более устойчивы к заражению разными болезнями.
На этом месте хочется остановиться поподробнее, так как не далее как вчера М.И. Куденков на лекции в МОИП высказал прямо противоположное мнение. Он считает, что выращенные в стерильной среде меристемные растения не имеют устойчивости к патогенам, соответственно чаще болеют и хуже приживаются. На мой уточняющий вопрос А. Диев ответил, что у него нет сведений о каких-либо научных исследованиях этого вопроса, свои выводы он сделал, исходя из общих логических заключений, а также из личных наблюдений. Многие свои растения он наблюдает уже в течение 3 лет после их микроклонального размножения, никаких негативных последствий на них он не замечал. Наоборот, высаженные после доращивания меристемные растения выглядят очень хорошо и производят впечатление полностью здоровых.
Технология микроклонального размножения имеет ещё ряд достоинств. При отработанной методике можно быстро и практически в неограниченных количествах размножить ценное растение, возникший новый клон и т.д. Технология позволяет питомниководу продуктивно использовать зимний период.
Не все культуры успешно размножаются микрочеренкованием, но их круг всё равно шире, чем культур, хорошо размножаемых обычным зелёным черенкованием. Проблемы возникают, в частности, с культурами, которые сильно «фенолят» – выделяют корнями в субстрат фенольные соединения, что приводит к отравлению самих меристемных растений, находящихся в замкнутой системе. Очень тяжело вводить в меристемную культуру хвойные, орехоплодные, луковичные. В целом для каждой культуры надо подбирать свои особенности технологии, что может потребовать разного количества времени и усилий. Также приходится подбирать свои условия и для микроклонального размножения разных сортов в рамках одной культуры. Поэтому сортимент введённых в меристемную культуру плодово-ягодных растений пока не очень велик.
К микроклональному размножению часто высказывают упрёк, что оно приводит к мутациям у получаемых растений. Соматические мутации возможны, но возникают не так часто, более того, в «Микроклоне» такие мутанты стараются выявлять и оставляют себе для исследований (на предмет получения более хозяйственно-ценных клонов). Действительно реальная проблема есть с сортами, которые являются химерами (например, сорт сирени «Сенсация»). В результате их размножения in vitro действительно часто наблюдается расхимеривание у части растений. Но это максимум 10%, при этом нормальные фирмы для таких случаев специально увеличивают поставляемую заказчику партию меристемных растений (скажем, при заказе на 100 штук выращивают 105).
В целом эта технология А. Диеву очень нравится, в планах расширение набора выращиваемых меристемных культур и сортов и продолжение наблюдений. В частности, пока открыт вопрос, не изменяется ли скороплодность плодовых культур при микроклональном размножении. Также интересно посмотреть, будет ли влиять выращивание деревьев на своих корнях на вкусовые качества плодов (в трудах Бербанка и Мичурина есть сведения о положительном влиянии корнесобственности).
Сайт Андрея Диева
http://www.lesovik.ru
P.S. На неделю покидаю столицу (и соответственно Форум), так что возможное обсуждение – без меня 
.